對難處理樣品及已降解RNA進(jìn)行靈敏、可重復(fù)的cDNA合成
理想的逆轉(zhuǎn)錄酶可以對大多數(shù)難處理RNA樣品進(jìn)行成功的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，例如由于制備過程中的降解反應(yīng)而通常僅含較少的RNA轉(zhuǎn)錄本的得自植物樣本的RNA。SuperScript? IV逆轉(zhuǎn)錄酶擁有極佳的可靠性和靈敏性，是對已降解RNA及含原料污染物的RNA進(jìn)行cDNA合成的極佳選擇（圖2）。
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圖2.使用多種已降解植物RNA進(jìn)行靈敏、可重復(fù)的cDNA合成，同時保持低突變水平。依照所提供的實(shí)驗(yàn)方案，在20 μL含隨機(jī)六聚體引物的SuperScript? IV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系中使用1-100 ng的已降解擬南芥總RNA（RIN:1-3）。依照其他供應(yīng)商所推薦的實(shí)驗(yàn)方案，使用其他供應(yīng)商的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將RT反應(yīng)所得的10%的cDNA加入到如圖表標(biāo)題所示的靶向TaqMan? Assays中。將平均Ct值對log10[起始RNA的ng數(shù)]進(jìn)行描點(diǎn)繪圖。另將每組起始RNA的標(biāo)準(zhǔn)差針對對測試的不同逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行描點(diǎn)繪圖。
RT反應(yīng)：每組輸入RNA中n=3，RT qPCR反應(yīng)：每組RT反應(yīng)中n=3。
高熱穩(wěn)定性適用于富含GC的模板以及反應(yīng)中的持久性
RNA的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)及富含GC的RNA模板均會影響cDNA合成。SuperScript? IV逆轉(zhuǎn)錄酶擁有極高的熱穩(wěn)定性，可在更高溫度下（高至55oC）獲得出色的表現(xiàn)，從而確?？蓪Ω缓壗Y(jié)構(gòu)的RNA進(jìn)行成功的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（圖3）。SuperScript? IV逆轉(zhuǎn)錄酶在RT反應(yīng)全程中均可保持完整的反應(yīng)活性，從而可在獲得全長cDNA中有更佳的表現(xiàn)。
圖3.SuperScript IV逆轉(zhuǎn)錄酶的高度熱穩(wěn)定性。根據(jù)所提供實(shí)驗(yàn)方案，在10 μL含oligo(dT)20的SuperScript? IV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系中加入500 ng的0.5–10 Kb RNA Ladder，但反應(yīng)溫度選取范圍為50-65°C間。通過堿性凝膠電泳將首鏈cDNA分離出來，隨后使用SYBR? Gold Nucleic Acid Gel Stain對cDNA進(jìn)行染色。使用NaOH使所有RNA水解，從而僅對cDNA進(jìn)行可視化分析。使用TotalLab軟件對每條cDNA條帶進(jìn)行測量，將每組溫度下所得的體積進(jìn)行相加。使用每組反應(yīng)溫度下的總體積與50°C下的總體積相比，通過其比率計(jì)算得到反應(yīng)活性百分比。
僅需10分鐘的加速的cDNA合成以及高得率的cDNA制備。
SuperScript? IV逆轉(zhuǎn)錄酶可在十分鐘內(nèi)合成9 kb長的cDNA，這是SuperScript? III逆轉(zhuǎn)錄酶及其他競爭產(chǎn)品做不到的（圖4、5）。
圖4.快速的cDNA合成速率。根據(jù)所提供實(shí)驗(yàn)方案，在10 μL含oligo(dT)20的SuperScript? IV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系中加入500 ng的Millennium? RNA Marker。依照其他供應(yīng)商所推薦的實(shí)驗(yàn)方案，使用其他供應(yīng)商的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但使用10分鐘的反應(yīng)時間。通過堿性凝膠電泳將首鏈cDNA分離出來，隨后使用SYBR? Gold Nucleic Acid Gel Stain對cDNA進(jìn)行染色。使用NaOH使所有RNA水解，從而僅對cDNA進(jìn)行可視化分析。
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圖5.SuperScript? IV逆轉(zhuǎn)錄酶的cDNA合成實(shí)驗(yàn)方案簡單，可輕松獲得全長cDNA。