突破性的體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑

Invivofectamine? 3.0試劑是一種突破性的體內(nèi)RNAi輸送試劑，可大幅改善實(shí)驗(yàn)性能，使用微克級(jí)的siRNA即可達(dá)到高達(dá)85%的敲低效果。

1. 易于使用—siRNA復(fù)合物只需數(shù)個(gè)步驟即可完成輸送
2. 高效、靶向敲低—在實(shí)驗(yàn)靶標(biāo)中可觀察到高達(dá)85%的敲低效果
3. siRNA樣品需求量更少—相比過(guò)去的試劑，最多可少用90%的siRNA完成有效敲低
4. 持續(xù)敲低能力—在單次注射后可觀察到更長(zhǎng)的敲低時(shí)間
5. 低毒性—復(fù)合物表現(xiàn)出極低的體內(nèi)毒性

易于使用

????? 用于轉(zhuǎn)染的Invivofectamine?3.0試劑及RNAi復(fù)合物非常容易獲得：只需簡(jiǎn)單地混合，并進(jìn)行孵育（30min）、稀釋、及注射即可（圖1）。?

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???????????????????????????????????????? 圖1.?僅需簡(jiǎn)單幾步快速制備可直接用于注射的RNAi/Invivofectamine? 3.0試劑復(fù)合物。

高效、靶向敲低

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圖2.使用Invivofectamine? 3.0試劑可在單次靜脈注射后即可在肝臟中實(shí)現(xiàn)靶向敲低。?Invivofectamine?3.0試劑與靶向Factor VII(FVII)或PPIB mRNA的siRNA組成的復(fù)合物，以每千克小鼠體重1 mg(mg/kg)的注射量進(jìn)行注射，最終靶向mRNA水平出現(xiàn)了高達(dá)85%的敲低（使用TaqMan?分析對(duì)敲低進(jìn)行評(píng)估）。

僅需更少的siRNA即可實(shí)現(xiàn)高效敲低

使用不同量的siRNA與Invivofectamine? 3.0試劑的復(fù)合物通過(guò)靜脈注射引入小鼠體內(nèi)。在注射后24小時(shí)使用顯色法對(duì)血清中的FVII蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)（圖3）。敲低水平與復(fù)合物中siRNA的含量正相關(guān)。Invivofectamine? 3.0試劑的ED50為0.1 mg/kg，相比而言之前的產(chǎn)品其水平為1.0 mg/kg。

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圖3、Invivofectamine? 3.0試劑與靶向FVII的siRNA在單次靜脈注射后可在肝臟中引起劑量反應(yīng)的敲低現(xiàn)象。?Invivofectamine?
3.0試劑與靶向FVII的Ambion? in vivo siRNA以0.02到2 mg/kg的劑量進(jìn)行注射。隨后分離血清并檢測(cè)FVII蛋白的水平（Biophen?顯色檢測(cè)

單次注射后具有持續(xù)敲低能力

單次注射Invivofectamine? 3.0試劑/siRNA復(fù)合物即可從第一天直到最多3周的時(shí)間內(nèi)獲得顯著的敲低結(jié)果（圖4）。提高siRNA在注射復(fù)合物中的含量可獲得持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的敲低結(jié)果，可超出檢測(cè)范圍。

圖4.使用三種不同濃度的靶向Factor VII (FVII)的siRNA研究劑量效應(yīng)。siRNA分子與Invivofectamine? 3.0試劑形成復(fù)合物后分別以1、0.5、及0.25 mg/kg的劑量進(jìn)行注射。在第2、5、9、16、23及30日收集血清，并使用顯色法對(duì)血清進(jìn)行分析以確定FVII蛋白的敲低效果。

體內(nèi)基因表達(dá)的敲低導(dǎo)致預(yù)期中的表型變化

Apolipoprotein B(ApoB)是低密度脂蛋白(LDL)的主要載脂蛋白，可將膽固醇攜帶至組織中。相應(yīng)地，對(duì)ApoB的表達(dá)降低程度進(jìn)行監(jiān)控的實(shí)驗(yàn)顯示出膽固醇及甘油三酸酯水平的降低。通過(guò)高效的敲低作用，Invivofectamine? 3.0試劑與靶向ApoB的siRNA形成的復(fù)合物已表現(xiàn)出可特異性地使膽固醇及甘油三酸酯的水平降低（圖5）。Invivofectamine? 3.0試劑的特異性及高效性使得研究人員更具有信心，即他們所觀察到的表型可歸因于特定的標(biāo)靶敲低，而不是非特異性的毒性作用。

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圖5、Invivofectamine? 3.0試劑及靶向ApoB的siRNA在單次靜脈注射后可在肝臟中達(dá)到敲低效果。?Invivofectamine? 3.0試劑與ApoB siRNA形成的復(fù)合物以1.5, 0.5,及0.25 mg/kg的劑量進(jìn)行注射。以1.5 mg/kg siRNA的劑量注射復(fù)合物可在mRNA水平引起>80%的敲低，在蛋白水平可引起~70%的敲低。對(duì)血清進(jìn)行分離并檢測(cè)膽固醇及LDL的含量，結(jié)果表明ApoB蛋白的敲低會(huì)導(dǎo)致膽固醇及LDL的含量顯著降低。

Invivofectamine? 3.0試劑融化后的穩(wěn)定性

Invivofectamine? 3.0試劑推薦的長(zhǎng)期保存溫度為–20°C，不過(guò)我們已通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Invivofectamine? 3.0試劑可在融化后于4°C條件下保存至少14天（圖6），從而使你可將實(shí)驗(yàn)延長(zhǎng)數(shù)天而無(wú)需重新冷凍該試劑。如果有必要，這款試劑可反復(fù)凍融多達(dá)4次而不會(huì)造成性能損失（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖6.保存于–20°C的Invivofectamine? 3.0試劑可進(jìn)行融解并在4°C下保存多至14天。將Invivofectamine? 3.0 Reagent解凍并與FVII siRNA制得復(fù)合物，并隨后以0.125及0.5 mg/kg的劑量進(jìn)行靜脈注射。?使用相同的融解試劑來(lái)制備用于首次注射后6及14天的第二次注射所需的復(fù)合物。當(dāng)注射過(guò)每組siRNA之后，收集血液并對(duì)FVII蛋白含量水平進(jìn)行評(píng)估（Biophen?顯色檢測(cè)）。結(jié)果表明解凍后并保存于4°C的Invivofectamine? 3.0試劑可在多至14天內(nèi)正常使用，性能并未出現(xiàn)下降。

極低的體內(nèi)毒性

為了評(píng)估Invivofectamine? 3.0試劑的體內(nèi)毒性，在試劑注射后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行血液化學(xué)分析及細(xì)胞因子檢測(cè)（圖7及8）。結(jié)果表明在使用Invivofectamine? 3.0試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染的每個(gè)個(gè)體間所檢測(cè)的生物標(biāo)志物的水平與未注射該試劑的個(gè)體相比并沒(méi)有顯著差異。

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圖7.對(duì)注射了Invivofectamine? 3.0試劑的小鼠樣品進(jìn)行血液化學(xué)分析。將Invivofectamine? 3.0試劑與靶向FVII的Ambion? in vivo siRNA的復(fù)合物分別以1 mg/kg [1], 3 mg/kg [3],或未處理[U]的劑量注射入小鼠體內(nèi)。在注射后2、24及48小時(shí)收集血液樣品，并通過(guò)臨床化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)數(shù)個(gè)生物標(biāo)志物(Antech)進(jìn)行評(píng)估：葡萄糖(GLU, in mg/dL)、堿性磷酸酶(ALP, in U/L)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT, in U/L)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST, in U/L)、總膽紅素(TBIL, in mg/dL)、膽固醇(CHOL, in mg/dL)、及甘油三酸酯(TRIG, in mg/dL)等。每條柱形圖均包含來(lái)自4組平行重復(fù)的數(shù)據(jù)。

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圖8.小鼠注射Invivofectamine? 3.0試劑后進(jìn)行取樣細(xì)胞因子分析。?將Invivofectamine? 3.0試劑與靶向FVII的Ambion? in vivo siRNA的復(fù)合物以0.25 mg/kg的劑量進(jìn)行注射（添加及未添加氟美松（Dex））。在注射后2、6、24及48小時(shí)后收集血液樣品，并使用多通路磁珠法免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測(cè)。將得自未經(jīng)試劑處理的個(gè)體中的樣品作為對(duì)照，使用相同的細(xì)胞因子panel法進(jìn)行檢測(cè)。每條柱形圖均包含來(lái)自3組平行重復(fù)的數(shù)據(jù)。