適用于CRISPR基因組編輯的一體式載體系統(tǒng)

???????轉(zhuǎn)染、富集、篩選并發(fā)表——使用我們的GeneArt? CRISPR核酸酶載體試劑盒均可完成。GeneArt? 規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù) (CRISPR)? 核酸酶系統(tǒng)提供了一種簡(jiǎn)單、即用的一體式表達(dá)載體系統(tǒng)，包括一個(gè)Cas9核酸酶表達(dá)框和一個(gè)向?qū)NA (gRNA)? 克隆表達(dá)框，可快速且高效地克隆編碼靶點(diǎn)特異性CRISPR RNA (crRNA)? 的DNA。您可以利用該系統(tǒng)，以序列特異性的方式編輯并改造您選擇的基因座。采用快速且使用方便的GeneArt?? CRISPR載體鑒別相關(guān)靶點(diǎn)，再利用GeneArt? Precision TAL精確構(gòu)建生物學(xué)相關(guān)的突變，實(shí)現(xiàn)高特異性和低脫靶效應(yīng)。

工作原理
????? 基因組編輯采用人工核酸酶及內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制改變細(xì)胞DNA。CRISPR/Cas系統(tǒng)利用短gRNA靶向細(xì)菌Cas9內(nèi)切酶至特定的基因座。鑒于gRNA的特異性，若要更改靶點(diǎn)只需更改編碼gRNA的序列的設(shè)計(jì)即可。

基因編輯中使用的CRISPR/Cas系統(tǒng)包括三個(gè)組分：

Cas核酸酶Cas9 (雙鏈DNA內(nèi)切酶)、靶點(diǎn)互補(bǔ)crRNA及輔助的反式激活crRNA? (tracrRNA) (圖1)。GeneArt?? CRISPR核酸酶載體的crRNA和tracrRNA共同表達(dá)為gRNA，以模擬細(xì)菌系統(tǒng)中的天然crRNA-tracrRNA復(fù)合物。唯一需要的是引入一條編碼目標(biāo)序列的雙鏈寡核苷酸，表達(dá)復(fù)合物的crRNA部分。

圖1. CRISPR/Cas9靶向的雙鏈斷裂。兩條鏈均出現(xiàn)剪切，剪切位點(diǎn)為靶序列的3’端的NGG前間區(qū)序列鄰近基序? (PAM) 序列上游的3個(gè)堿基處。

GeneArt? CRISPR核酸酶載體試劑盒

GeneArt?? CRISPR核酸酶載體試劑盒是一種報(bào)告基因載體系統(tǒng)，可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中CRISPR/Cas9基因組編輯所需的功能組件的表達(dá)。該試劑盒可提供兩種不同的報(bào)告基因：采用帶有橙色熒光蛋白? (OFP) 的GeneArt? CRISPR核酸酶載體，可實(shí)現(xiàn)表達(dá)Cas9和CRISPR RNA的細(xì)胞群體的流式細(xì)胞術(shù)分選 (熒光激活細(xì)胞分選法? (FACS))，而使用帶有CD4的GeneArt? CRISPR核酸酶載體，可實(shí)現(xiàn)表達(dá)Cas9和CRISPR RNA的細(xì)胞的微珠富集 (圖2)。

線性化的GeneArt?? CRISPR核酸酶載體提供了一種快速高效的方法，將編碼理想靶點(diǎn)crRNA的雙鏈寡核苷酸克隆至表達(dá)框內(nèi)，實(shí)現(xiàn)Cas9核酸酶的序列特異性靶向。

圖2. GeneArt? CRISPR核酸酶載體圖譜。使用預(yù)線性化的載體? (帶有5個(gè)堿基對(duì)突出末端)，輕松克隆編碼靶點(diǎn)特異性crRNA的雙鏈DNA寡核苷酸。圖譜為帶有 (A) OFP報(bào)告基因和 (B)? CD4報(bào)告基因的載體。gRNA、Cas9和報(bào)告基因均通過相同載體表達(dá)。Cas9通過核定位信號(hào)靶向細(xì)胞核 (NLS1和NLS2)。