適用于CRISPR基因組編輯的一體式載體系統(tǒng)

???????轉染、富集、篩選并發(fā)表——使用我們的GeneArt? CRISPR核酸酶載體試劑盒均可完成。GeneArt? 規(guī)律成簇間隔短回文重復 (CRISPR)? 核酸酶系統(tǒng)提供了一種簡單、即用的一體式表達載體系統(tǒng)，包括一個Cas9核酸酶表達框和一個向導RNA (gRNA)? 克隆表達框，可快速且高效地克隆編碼靶點特異性CRISPR RNA (crRNA)? 的DNA。您可以利用該系統(tǒng)，以序列特異性的方式編輯并改造您選擇的基因座。采用快速且使用方便的GeneArt?? CRISPR載體鑒別相關靶點，再利用GeneArt? Precision TAL精確構建生物學相關的突變，實現高特異性和低脫靶效應。

工作原理
????? 基因組編輯采用人工核酸酶及內源性修復機制改變細胞DNA。CRISPR/Cas系統(tǒng)利用短gRNA靶向細菌Cas9內切酶至特定的基因座。鑒于gRNA的特異性，若要更改靶點只需更改編碼gRNA的序列的設計即可。

基因編輯中使用的CRISPR/Cas系統(tǒng)包括三個組分：

Cas核酸酶Cas9 (雙鏈DNA內切酶)、靶點互補crRNA及輔助的反式激活crRNA? (tracrRNA) (圖1)。GeneArt?? CRISPR核酸酶載體的crRNA和tracrRNA共同表達為gRNA，以模擬細菌系統(tǒng)中的天然crRNA-tracrRNA復合物。唯一需要的是引入一條編碼目標序列的雙鏈寡核苷酸，表達復合物的crRNA部分。

圖1. CRISPR/Cas9靶向的雙鏈斷裂。兩條鏈均出現剪切，剪切位點為靶序列的3’端的NGG前間區(qū)序列鄰近基序? (PAM) 序列上游的3個堿基處。

GeneArt? CRISPR核酸酶載體試劑盒

GeneArt?? CRISPR核酸酶載體試劑盒是一種報告基因載體系統(tǒng)，可用于哺乳動物細胞中CRISPR/Cas9基因組編輯所需的功能組件的表達。該試劑盒可提供兩種不同的報告基因：采用帶有橙色熒光蛋白? (OFP) 的GeneArt? CRISPR核酸酶載體，可實現表達Cas9和CRISPR RNA的細胞群體的流式細胞術分選 (熒光激活細胞分選法? (FACS))，而使用帶有CD4的GeneArt? CRISPR核酸酶載體，可實現表達Cas9和CRISPR RNA的細胞的微珠富集 (圖2)。

線性化的GeneArt?? CRISPR核酸酶載體提供了一種快速高效的方法，將編碼理想靶點crRNA的雙鏈寡核苷酸克隆至表達框內，實現Cas9核酸酶的序列特異性靶向。

圖2. GeneArt? CRISPR核酸酶載體圖譜。使用預線性化的載體? (帶有5個堿基對突出末端)，輕松克隆編碼靶點特異性crRNA的雙鏈DNA寡核苷酸。圖譜為帶有 (A) OFP報告基因和 (B)? CD4報告基因的載體。gRNA、Cas9和報告基因均通過相同載體表達。Cas9通過核定位信號靶向細胞核 (NLS1和NLS2)。