大神們都在研究的外泌體是什么？
發(fā)布時間：2016-4-15
外泌體是包含了復雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡 (30-150nm)。 所有培養(yǎng)的細胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。 有關他們分泌和攝取及其組成、“運載物”和相應功能的精確分子機制則剛剛開始研究。 外泌體目前被視為特異性分泌的膜泡，參與細胞間通訊。無論是對其功能，還是對如何將其用于微創(chuàng)診斷的開發(fā)的研究都日益增長。
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功能
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研究發(fā)現(xiàn)外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等。不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，能很好的保護其包被的物質(zhì)，且能靶向特定細胞或組織，因此是一種很好靶向給藥系統(tǒng)（targeted delivery system）。
具體功能：
?有助于細胞成熟過程中等離子體膜蛋白的移動
?傳遞大分子信息(RNA和蛋白質(zhì))，使細胞間信息傳遞
?促進免疫反應、抗原呈遞、程序性細胞死亡、血管生成、炎癥反應、凝聚
?腫瘤細胞分泌的外泌體可促進致癌基因的傳播
?在極性產(chǎn)物的生長和分化期間形成轉(zhuǎn)運蛋白
?朊病毒等病原體的傳播以及病毒的細胞間傳播
?通過分泌化學誘導信號幫助網(wǎng)柄菌細胞遷移
?母乳中包含miRNA的外泌體，有助于增強嬰兒免疫系統(tǒng)
exosome的分離
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早前發(fā)表的一些研究主要是從淋巴細胞、胚胎干細胞以及血清、唾液和母乳中提取出exosome并回收RNA，再利用qRT-PCR和新一代測序來進行鑒定和分析。它們在分離時往往是采用超速離心的方法。這的確是一種經(jīng)典的方法，能制備出干凈的exosome。
但是，缺點也不少：
傳統(tǒng)分離方法缺點：
耗時耗力，往往需要8-30個小時；
每次最多只能處理6個樣品；
需要大量的起始材料；
產(chǎn)量不高。
最重要的是——你得有臺超速離心機，還要有豐富的經(jīng)驗。
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如果有個試劑盒，像提質(zhì)粒那樣輕松地提取出exosome，那就再好不過了。
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賽默飛世爾公司旗下Invitrogen品牌推出了多款總exosome提取試劑盒，能分別從細胞培養(yǎng)基、血清、血漿、尿液及其他體液中分離完整的exosome。與超速離心相比，這種方法實在是簡單省事多了。
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試劑盒原理
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這種試劑通過捆綁水分子，將溶解度不太高的組分（如囊泡）擠出溶液，從而可通過常規(guī)離心來收集。樣品先經(jīng)過2000xg 30分鐘低速離心以去除細胞碎片，根據(jù)樣品類型加入指定比例的提取試劑并混勻，并在2-8°C孵育一定時間（血清樣品只需4度孵育30分鐘，培養(yǎng)基上清則需孵育過夜），然后通過常規(guī)離心（10,000 x g，10-60分鐘，因樣品類型而異）即可回收exosome沉淀。其中手動操作部分僅需15-20分鐘，甚至比提質(zhì)粒還簡單。之后用PBS或類似溶液重新溶解沉淀。這下，exosome可立即用于下游分析或進一步的純化啦。
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試劑盒效果
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賽默飛的平行比較試驗結(jié)果顯示，試劑法與超速離心法提取出的exosome相當。在NanoSight? LM10儀器上分析的圖譜顯示，所有囊泡均小于300 nm，且大部分處于exosome的典型大小范圍30-150 nm（圖1）。
圖1. 從HeLa細胞培養(yǎng)基中回收的Exosome的分析。(A) 采用總Exosome提?。◤募毎囵B(yǎng)基中）回收的Exosome的大小分布與 (B) 采用傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度超速離心實驗方案提取的Exosome相當。
進一步處理總exosome——分離亞群
?????? 在獲得了總的exosome之后，您還可以通過磁珠提取出高純度的亞群。例如Dynabeads?磁珠可捕獲表達CD63的exosome，用于下游的流式細胞儀、電鏡或Western blotting分析。超順磁的Dynabeads呈淺棕色，因此在整個操作過程中您都可以“查看”您的樣品。此外，樣品量和磁珠量也能輕松調(diào)整。當然，您也可以不選CD63，而通過生物素化的抗體和鏈霉親和素試劑來富集您感興趣的亞群。
完整exosome的分析
分離過程結(jié)束后，您可能想要觀察和確認一下這些小囊泡。不過，exosome的觀察還真不簡單，因為它們太小了。目前，研究人員多借助以下工具和方法。
在收集到exosome之后，我們可利用NanoSight? 儀器來分析囊泡的大小范圍和濃度。這款儀器根據(jù)Stokes-Einstein 原理，將每一個進行布朗運動的顆粒直徑計算出來。它既提供直接實時的納米顆粒觀察，也給出全面的顆粒粒徑分布分析。
若沒有NanoSight，那也沒關系。通過RNA或膜組分的標記，我們也能在顯微鏡下觀察exosome。賽默飛還提供了專門的Exosome離心柱（MW 3000），能夠快速去除未摻入的染料。同時，這些離心柱也能用于緩沖液交換，或去除低分子量的雜質(zhì)，如鹽、核苷酸和小的寡核苷酸。此外，經(jīng)過Dynabeads?磁珠富集的亞群可直接用于電鏡和流式細胞儀（圖2）。
圖2. 利用流式細胞儀觀察CD63+ Exosome。Exosome結(jié)合至包被有CD63（A和B）的乳膠微球或包被有生物素化的CD63（C和D）的Dynabeads? 鏈霉親和素上，并進行CD63-PE染色。FSC/SSC (1,500次)和熒光直方圖如圖所示。
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exosome貨物的分離與分析
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核酸與蛋白的分析對于許多研究人員來說已經(jīng)是駕輕就熟了。賽默飛的總Exosome RNA和蛋白分離試劑盒能夠從同一樣品中分離蛋白和總RNA。試劑盒的標準化操作為實驗帶來可重復的結(jié)果。此外，您也可以通過Exosome免疫沉淀試劑盒，借助Dynabeads?磁分離技術(shù)來溫和地分離出完整的exosome蛋白復合物。
這之后，就等你大顯身手了。無論是利用Western blot來分析exosome蛋白，或是利用qRT-PCR或RNA-seq來分析RNA，exosome這種信號傳導的新途徑無疑將為您揭開一個新的研究篇章。
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????????exosome這些迷人的小卡車，每天兢兢業(yè)業(yè)地在細胞之間穿梭，傳遞著重要的訊息。盡管這還是個年輕的研究領域，但有了不斷上市的新工具，相信我們對exosome的了解會更加深入，更多exosome的秘密將會揭開。
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